Yumurta toplama işleminin ardından bu kez kadından alınan yumurta ve erkekten alınan spermler laboratuvar ortamında döllenir. Bu embriyo transferi gerçekleştirilmeden önce ki son adımdır.

Yumurta toplama (OPU) işlemi sırasında emilerek alınan follikül içeriği hemen laboratuvara gönderilir. Özel bir mikroskopla incelenen bu sıvının içinde bulunan yumurtakültür sıvısının içine konarak inkübatör denilen aygıta kaldırılır. İnkübatör, sıcaklığı 37 oC, karbondioksit oranını da %5 – 6 düzeyinde sabit tutar. Olgun yumurta hücreleri 4 – 6 saatsonra döllenme için hazır hale gelir. Uyarılma sonrası çapı 18 – 22 mm arasında olan folliküllerin yaklaşık %80’inden döllenmeye uygun olgun yumurta elde edilebilir.

Kadından yumurtaların (oositlerin) toplandığı esnada erkek de sperm verir. Sperm alınması içn en ideal yöntem mastürbasyondur. Menisinde canlı sperm bulunamayan kişilerde ise cerrahi olarak sperm aranır. Elde edilen meni özel bir kap içine alınır ve sıvılaşması olması beklenir. Sıvılaşan meni, sperm sayısı, hareketliliği ve şekli yönünden incelenir.

Tüp bebek planlanan hastalarda en önemli kriter hareketli sperm sayısıdır. İncelenen sperm döllenme için hazırlanır. Sperm hazırlaması iki nedenden dolayı önemli. Bunlardan birincisi menide bulunan yabancı proteinleri temizlemek, ikincisiyse  bazı reaksiyonları tetikleyerek spermin hiperaktif olmasını sağlamak.

Yumurta kültürü ve sperm hazırlanması tamamlandıktan sonra döllenme işlemine geçilir. Spermlerle yumurtalar buraya bırakılırlar. Her bir yumurta hücresi için 20.000 sperm kullanılır. Sperm parametrelerinin bozuk olduğu durumlarda bu sayı arttırılabilir. Erkek faktörü varlığında veya nedeni açıklanamamış infertilite olgularında mikroenjeksiyon (ICSI) tercih edilmeli. İşlemden 16 – 18 saat sonra döllenme olup olmadığı kontrol edilir. Döllenmiş yumurtada tek olan hücre sayısı ikiye çıkmıştır.

Döllenmiş yumurtalar tekrar kültür ortamına konur ve ileri aşamalara ulaşmaları beklenir.Uygun aşamaya gelindiğinde embriyolardan kaliteli olanlarından belirli bir sayıda alınarak kadının rahmi içine transfer edilir.